图解微流控｜第9期

固化型聚合物的分子是体型结构，在受热时也发生软化，可以塑制成一定的形状，但受热到一定的程度或加入少量固化剂后，就硬化定型，此后再加热也不会变软和改变形状。聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片是最主要的固化型聚合物芯片，也是目前研究最多，使用最广泛的一类芯片。透气和弹性是PDMS芯片两个最主要的特征。PDMS的透气性使得在芯片上集成细胞培养以及研究成为可能^[23-27]，还可用于研究微通道内流体在密闭状态下的蒸发，并实现溶剂的替换^[28]；PDMS的弹性首先被用于微印刷^[29-30]，也是制作微气动泵阀的物理基础^[31-40]。

PDMS微流控芯片表面问题非常复杂^[41]。首先，PDMS表面高度疏水，未处理的PDMS表面水接触角为108º，在清洗芯片和电泳分离时，微通道内非常容易产生气泡，使流路断开，造成实验失败；其次，PDMS芯片是多孔的，被吸附的疏水小分子如果其动力学直径小于PDMS芯片微孔直径，就会向芯片内部扩散、迁移，这不仅会造成样品的损失，也会造成PDMS芯片自身的溶胀、芯片表面的扭曲以及微通道的变形；最后，PDMS芯片表面是动态变化的，由于芯片中的分子没有完全共价交联，分子有一定的自由度，表面附近分子可以转换分子构象，芯片内部自由分子可以向芯片表面迁移，经表面改性得到的亲水性表面会自发恢复其疏水的状态，这极大地限制了表面改性芯片的使用时间，降低了芯片运行中的重现性。复杂的芯片表面性质，是近期内制约PDMS芯片广泛应用的一个主要因素。只有不断加强对PDMS表面性质与表面修饰的研究，才能逐渐解决这些问题，提高PDMS芯片的性能，扩大PDMS芯片的应用范围。

3.4.1 本体掺杂

PDMS芯片表面有许多微孔，这些微孔可以吸收并交联一些小分子^[42]，或嵌套一些大分子^[43-44]。利用这一性质，在PDMS的预聚体中引入特殊性质分子，芯片固化后，这些分子可以向芯片的表面迁移，从而改变芯片表面的性质。

Huang小组^[43]在PDMS的预聚体中加入非离子表面活性剂DDM，它的疏水基连接PDMS，亲水基连接生物素分子如Bio-DOPE。在缓冲液中特定的生物素分子可以偶联具体的蛋白质，从而达到固定蛋白和消除PDMS表面不确定吸附的目的（图3-15）。利用该种芯片，他们进行了荧光标记连锁状球菌的单分子荧光成像分析。

3.4.2 共价偶联

大部分PDMS表面共价涂层是基于其表面上活化的羟基，利用一些物理手段，如等离子体、紫外、臭氧等，可以将PDMS芯片表面甲基快速转化成羟基，其中主要是硅羟基。各种物理手段中，以氧等离子体最常用^[45]，一方面是因为其快速，1 min内就能够完成；另一方面，其表面活化的效果明显，可以在芯片表面产生大量的活性基团如硅羟基、醇羟基和羧基，使表面变得极度亲水，水接触角几乎为零。但这种活化的PDMS表面很快会恢复其疏水性，因此极大地限制了应用的周期^[46]。

针对以上问题，作者实验室将环氧修饰的亲水性聚合物直接共价偶联到芯片表面^[47]，主要方法为：首先用等离子体活化PDMS表面，产生大量的硅羟基；然后将环氧修饰的亲水性聚合物快速吸附在活化的PDMS表面；最后在110℃条件下加热，交联聚合物分子中的环氧基团与PDMS表面的羟基，从而将亲水性聚合物偶联到芯片表面（图3-16）。整个改性过程可在半小时内完成，表面聚合物涂层可以完全抑制电渗流，减少蛋白质样品吸附。这一聚合物涂层芯片可用于高效分离碱性蛋白质、多肽及核酸片段，图3-17为在该涂层芯片上电泳筛分PBR322/MspⅠ核酸标准混合物，在3 cm分离距离，250 s内，有效分离塔板数为5.5×104 /m。

3.4.3 聚合诱导接枝

聚合诱导接枝中的表面分子脱氢介导聚合在PDMS芯片上也取得了不错的修饰结果。用紫外线直接照射单体溶液就可以在PDMS的表面接枝一些亲水性的化合物^[48]，如聚丙烯醇、聚乙二醇等，但是反应溶液的组成需要严格的控制，同时必须添加一定量的高碘酸钠和苯甲醇，以提高单体向芯片表面扩散的效率，抑制溶解氧对聚合反应的淬灭作用。反应的基本过程如图3-18所示，一般需要几个小时，也要花很多的时间从表面除掉均聚物。Hu小组^[49]将此方法改进，首先在PDMS表面吸附了二苯甲酮（BP）等光引发剂，这样就不必在单体溶液中再添加光敏剂，解决了均聚的问题，聚合的时间也缩短至几分钟。

3.4.4 吸附-交联

动态改性中的吸附剂往往被加在运行缓冲液中，这些物质和被分离物质之间有时会产生一些不必要的相互作用，而且常和一些检测方式比如质谱等不兼容。如果将一些可用于动态吸附的物质加以交联，增加他们在芯片上附着力，代替在缓冲液中的添加，则可以解决这个问题^[50]。

作者课题组基于聚乙烯醇（PVA）与氧等离子体处理的PDMS表面，以及PVA涂层改性PDMS芯片表面的方法，建立了一种多层PVA改性PDMS芯片表面的方法^[51]。主要步骤为在氧等离子体快速活化的PDMS芯片表面，多次循环吸附PVA，加热交联多层PVA涂层（图3-19）。结果表明：未经氧等离子体活化的PDMS芯片表面不能有效吸附PVA；在氧等离子体活化PDMS芯片表面，88%水解的PVA涂层效果优于100%水解的PVA；重复涂层三次为最佳。在这种三次88%水解PVA涂层的PDMS芯片上，可以极大的抑制电渗，并且可以实现自由溶液芯片电泳分离碱性蛋白质（图3-20）和酸性蛋白质，也可以实现芯片电泳筛分核酸片段混合物，其中碱性蛋白质和核酸片段的理论塔板数可达百万/米。

采用不同的方法对微流控芯片表面进行改性后，还需要对改性后的表面进行表征，其目的是检测改性过程，考察改性效果。表面改性的表征方法很多，本节主要从作者实验室的研究成果出发，分别介绍红外吸收光谱、原子力显微镜、荧光照片和电渗流测量等几种常用且方便的表征方法。

表面红外漫反射吸收光谱是一种比较灵敏的表面探测工具，可以快速测量表面化学组成变化，经常用于表面修饰的表征。在多层PVA改性PDMS芯片表面实验中^[51]，红外光谱研究发现，涂层三次以内，表面羟基吸收不断增强，但第四次涂层没有增加表面PVA的吸附量（图3-21），因此实验中使用PVA三次涂层芯片。

通过原子力显微镜可以直接观察表面分子，考察表面偶联的聚合物分子层状况。未经处理的PDMS表面很平整，氧等离子体处理后表层完全转化为类似二氧化硅的结构，表面粗糙度不会增加。但等离子体处理时间延长、处理功率增大，会使处理后的芯片表面产生随机裂纹，如果等离子体功率进一步加大，由于类二氧化硅层和PDMS本体膨胀系数的差别，会使表面的裂纹增加，形成规律性的褶皱^[52]。作者实验室使用的氧等离子体功率偏大，氧气压力也偏大，因此会在芯片的表面产生褶皱，如图3-22所示，亲水性聚合物修饰的PDMS表面，褶皱分布均匀，宽度100-200 nm、深度10-20 nm，在这种芯片表面很难准确测定聚合物分子的形貌。选择以单晶硅的氧化层作为衬底，在聚合物修饰的氧化硅表面，可见明显突起，这表明聚合物已经成功偶联在氨基化芯片的表面^[53]。

借助荧光照片，可以测试表面连接的聚合物涂层对表面蛋白吸附情况。作者实验室利用氨基和环氧间的交联反应，在PDMS表面共价偶联环氧修饰的亲水性聚合物^[53]。为了考察聚合物涂层对表面蛋白吸附的影响，将荧光标记的牛血清蛋白（BSA）和溶菌酶（lys）分别在不同表面处理的PDMS芯片微通道内作吸附测试（图3-23）。由图3-23可以看出，在未处理的PDMS通道内，可以观测到明亮且均一的荧光图象，表明两种蛋白被PDMS表面强烈吸附。经过硅烷化后，两种蛋白的吸附仍很明显。当芯片通道经过聚合物涂层后，两种蛋白的吸附明显减少，荧光强度大约只相当于未处理芯片的5-10%。

电渗流（EOF）是由固相表面的电荷引起的，因此可以反映表面的电荷多少，以及表面修饰的结果。仍以多层PVA改性PDMS芯片表面实验^[51]为例，采用电流监测法来测定PVA涂层PDMS微通道内电渗的变化，以此来反映涂层的效果。相比于未经处理的PDMS芯片表面，多层 PVA改性芯片的EOF明显减小（图3-24），表明PVA覆盖了芯片表面的绝大部分，且电渗的大小与PVA吸附-交联的次数无关。另外微通道表面的电荷的多少与pH的大小也有关系。如图3-25所示，未经处理的PDMS的表面的EOF随pH的增大而增大，而三层88% PVA修饰过的PDMS芯片的电渗流速一直稳定在0.25×10^-4 cm²/(V·S)，这也表明在这种情况下，PVA覆盖了整个表面。

文章来源：《图解微流控芯片实验室》林炳承、秦建华 著