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前沿资讯 |大尺寸螺旋微流体通道——通过二次流的稳定和加速实现对流速和粒径的不敏感聚集发表时间：2024-02-23 14:43  大家好!今天为大家分享一篇2024年一月发表在Analytical chemistry上的文章，题目为“Spiral Large-Dimension Microfluidic Channel for Flow-Rate- and Particle-Size-Insensitive Focusing by the Stabilization and Acceleration of Secondary Flow”。山西农业大学生命科学学院的申少斐团队提出了一种具有有序微观结构（SLDCOM通道）的螺旋大维通道（宽900μm，高100μm），以实现流速和粒度不敏感聚焦（图1A）。本文的通讯作者为山西农业大学生命科学学院的申少斐。 研究背景 操纵微米大小的颗粒在各个领域都具有巨大的应用潜力，包括生命、化学和材料科学。微流控技术通过在微观尺度上提供对流体行为的精确控制，已成为粒子/细胞高通量聚焦的热门技术。主动聚集技术，如磁泳，介电泳，以及声泳等，需要外部动力才能更准确地操作目标样品。相比之下，被动聚焦技术基于内部流体动力学或通道几何，如横向位移，几何效应和惯性效应，这使得它们更易于制造、维护、运行通量更高。其中惯性流表现出相当大的优势，包括能够持续高效地处理样品，无需特异性标记，非接触操作等，通过微观流体动力学效应在操纵颗粒或流体方面表现出卓越的性能。惯性流聚集取决于可以决定粒子和细胞在运动中横向迁移的流体动力，受到通道几何的影响，通道几何设计是流体力学的重要部分，关键参数的调节使惯性微流体能够在各个领域广泛采用，包括临床诊断、生化分析和环境监测。其中，微流控惯性流设计在单细胞聚集和循环肿瘤标志物的分离中取得了巨大进展。然而，由于缺乏全面和有效的方法来稳定控制迪恩（Dean）流，使得有效控制粒子/细胞螺旋通道的发展具有挑战性，特别是在实现不同尺度颗粒的惯性聚集和流量操作方面。此外当通道尺寸较大时（宽度： >600 μm，高度： >80 μm），Dean二次流较弱，阻碍了粒子的快速横向运动和有效集中，因此目前的常规设计中螺旋通道通常尺寸通常较小，限制了样品处理通量。因此，开发一种创新的螺旋微通道，能够稳定和加速大维通道中的二次流动，仍然是惯性微流控领域的一项迫切且具有挑战性的任务。 基于此，Shaofei Shen等人提出了一种具有有序微观结构（SLDCOM通道）的螺旋大维通道（宽900μm，高100μm），以实现流速和粒度不敏感聚焦（图1A）。 与传统的螺旋通道不同，迪恩流在不同环路之间大小不同，独特的“大缓冲区”和“小缓冲区”在螺旋微通道中（图1B）稳定并加速了二次流动。高效的粒子聚焦可以通过独特的迪恩二次流来实现，它以一种流速不敏感的方式工作。此外，通过对微通道中不同大小和类型的颗粒和活癌细胞在相似位置内进行一致和畅通的惯性聚焦，证明了颗粒大小不敏感聚集的可靠性。最后成功地实现了3D细胞的聚焦，证明了其在聚焦不同大小和类型的活细胞方面的功效。  图1 在设计的通道中，不同大小颗粒的聚焦过程示意图。(A)对不同尺寸粒子的聚焦过程示意图。粒子轨迹受到四种力的相对强度的影响，包括剪切诱导升力（FLS）、壁面诱导升力（FLW）、Saffman升力（FLΩ）和Dean阻力（FDD）。(B)缓冲区的分布。(C)所设计的微观结构的尺寸。 图文导读 理论和微通道设计：通道的垂直尺寸沿z轴用H表示，长度为100 μm。微通道的y轴宽度为900 μm。芯片沿x轴的整个长度达到90cm。微观结构和SLDCOM通道设计的细节如图1所示。该独特的配置保证了粒子/细胞可以穿越足够长的通道来产生一个稳定的聚焦状态。如图1A所示，不同大小颗粒的聚焦过程通常包括迪恩阻力(FDD = 3πμUDɑp，其中μ、UD和ɑp分别为流体粘度、迪恩流的横向速度和颗粒直径）、惯性升力(FL = ρG2 CLɑp4，其中ρ、G、CL、ɑp分别为流体密度、与流速和特征长度相关的剪切速率、升力系数和颗粒直径）和萨夫曼升力(FLΩ，源自颗粒的旋转）。颗粒在流体流动中所经历的升力（FL）由两个部分组成：壁诱导升力（FLW）和剪切升力（FLS）。在这些动力的作用下，不同大小的颗粒可以沿着平衡线集中在靠近内壁的区域附近。最后，它们可以逐渐形成单流聚焦，当它们通过连续的循环时，会接近内壁边缘的平衡位置。众所周知，除了通道雷诺数（Re = ρUDh/μ），迪恩流的强度和分布明显受通道几何结构的影响，包括高度差和纵横比（H/W），其中ρ是流体密度，U是通道的最大速度，μ是流体粘度，Dh为微通道的水力直径。迪恩流的减少不利于FDD实现粒子的惯性聚焦。在螺旋微通道内的微结构诱导的二级流，类似于类迪安流，但与在传统螺旋通道中观察到的传统迪安流不同，微观结构产生的二级流在影响迪安阻力（FDD）大小方面表现出与迪恩流相当的特性。这一特性对于辅助粒子和细胞的惯性聚焦是十分关键的。 迪恩二次流特性：在SLDCOM通道中选择了13个截面（部分1、3、5、7、9、11和13，如图1所示）来研究迪恩流的大小和分布。选择大维通道（SLDCOM通道）的螺旋芯片作为对照，微观结构诱导的二次流在上、下平面上有两个反向旋转的涡旋，类似于传统通道中迪恩流的独特分布（图2）。然而，SLDCOM通道中两个反旋涡的涡中心分布更接近内壁，这与内外壁对称的迪恩流不同（图2A、B）。此外该迪恩流的幅度远远高于传统通道。旋涡中心附近的流速存在显著差异，SLDCOM通道可以比传统通道提高10倍（图2C，D），该差异增加了捕获聚焦粒子的能力。由于在每个回路曲率值的变化，传统的螺旋通道可能会产生不同大小的迪安流，因此螺旋通道的设计主要依赖于试错，特别是对于敏感的操作流速，可能需要进行几次试验才能找到优化设计。对于不同尺寸的聚焦颗粒，明显缺乏系统的设计规则。  图2 不同界面处Dean流分布情况：（A,B）不同横截面二次流增强分布模拟；（C,D）不同流速条件下设计的通道和常规螺旋通道速度分布的定量分析 在本文设计的SLDCOM通道的13个观测区域中，迪恩二次流的大小几乎是相同的，而二次流的强度显著增加。与在x方向上增加流量相比，这种迪恩二次流加速被证明是诱导粒子/细胞横向位移的一种更有效的方法。由微观结构产生的迪恩二次流的独特特性会降低实现稳定惯性聚焦所需的流量的灵敏度。此外，为了深入了解SLDCOM通道的横截面流动动力学，提取和比较微观结构狭窄区域内不同位置的二级流动的分布。流体通过一个特定的过程分布和排列在不同的区域，证明两种微观结构之间的“缓冲区”在促进流体的快速流动和有效的粒子运动方面发挥着至关重要的作用。有序的微观结构尺寸限制可以改变横向流动，从而提高流动的稳定性。流体被收集并有序地分散在封闭区域内，流动方向指向外通道壁，然后又指向内通道壁。在最窄的区域（区域3）产生迪恩二次流，导致流体和颗粒的快速运动。两个微观结构之间存在“大缓冲区”，微观结构附近产生“小缓冲区”，使得流体速度连续变化，导致SLDCOM通道中二次流的逐渐改变。粒子在y轴上运动的主要决定因素是由增强的类二次流引起的驱动力变化。在传统螺旋通道结构中，由于二次流体较弱，粒子在大维通道中的y向迁移难以聚集。与惯性升力不同，FDD通常不会随颗粒径有显著变化。因此，通过增加液体动力，SLDCOM通道可以有效地实现不同大小粒子的聚焦状态。该迪恩二次流增强方法，通过“大缓冲区”和“小缓冲区”的独特配置，是在高效和稳定性方面提供流速和颗粒尺寸不敏感聚焦的有效方案。 粒子聚焦表征：为了检验SLDCOM通道中迪恩二次流的影响，使用15μm粒子进行了分析，以评估它们在狭窄区域13和出口区域15的动态轨迹和聚焦能力。通过对数千个成像轨迹的统计分析而生成的等高线图，来精确地描述不同流动条件下的粒子状态。在区域13中，SLDCOM通道可以在大流速范围（0.5−6 mL min−1，Re=66.7−400）下有效地对状态2中的粒子进行单流聚焦，如图3A所示。当流速较低（0.1 mL min−1，Re=6.67）时，低程度的二次流不能有效地促进颗粒在大维通道宽度的横向迁移，粒子处于分散状态。随着流量的增加，四个不同的阶段模型成功地描绘了粒子在单一流中聚焦的情况（图3B）。在状态2a中，FDD 和FL在促进粒子不断靠近内壁方面起着主导作用。当粒子的聚焦位置接近内壁时，FDD 和FL的有效性降低，由于是大维通道宽度，FL的减小几乎可以忽略不计。与传统螺旋通道中的FDD相比，SLDCOM通道中的FDD由于在y方向上的迪恩二次流差异较大，因此粒子可以很容易地定位平衡位置。即使流量进一步增加，这两种力对粒子横向迁移的影响仍然相似。由于FLΩ的增加，颗粒被迫在接近通道中心的迪恩流中循环。FLΩ对流速呈微弱的反依赖性。在2b−2d状态下，大范围流速下，聚焦位置可以稳定在靠近内壁的位置。随后颗粒和内壁之间的间隙增加，导致状态2d中的颗粒重叠。如图3C，D所示，当粒子在33.35~366.8的Re范围内，对应0.5~4 mL/min时，可以观察到距离内壁约45 μm的狭窄聚焦位置。当Re从300增加到466.7，相当于4.5−7 mL/min时，集中的粒子流变得更加扩散，稳定点更接近外壁。实验结果表明，SLDCOM通道能够有效地调节侧向流量和FDD。同时，FLΩ和FDD之间不断变化的竞争可能会降低惯性聚焦过程中流速的灵敏度。因此相比于传统螺旋通道结构，该设计具有在较广的流速范围内操纵粒子的能力。  图3 粒子轨迹模拟：(A)不同流动条件下的聚焦状态；(B)粒子状态分布的详细示意图；(C)FITC标记的聚苯乙烯颗粒在变化流速条件下的运动轨迹。(D)在变化的流速条件下，粒子聚焦到特征结构的距离情况 相应地，这些现象也可以在区域15中发现(图4A,B)。由于区域15（1 mm宽）的不对称膨胀，粒子聚焦位置为距离内壁110 μm处。对SLDCOM通道内粒子聚焦过程的稳定性进行了评估(图4C)，在60 min内的大流速（0.5−4.5 mL/min）范围下表现出99.9%的显著粒子聚焦效果（图4D）。长期保持粒子聚集的稳定性对于惯性平台的高效运行至关重要，特别是当它被用于细胞操纵时。这项研究成功地开发了一种设备，可以在很长一段时间内保持一致和可靠的颗粒浓度，这在其他微流体芯片中是没有实现过的。高速摄影的明场图像显示了粒子的高通量三维（3D）聚焦（图4E），与以前的微尺度聚焦技术仅在特定的流量下工作相比，由SLDCOM通道完成的聚焦明显不容易受到流量条件波动的影响，特别是在流量较高的情况下。这一特性对粒子领域的应用十分有利，因为它允许选择各种流动条件来实现最佳的聚焦，而不是依赖于一个固定的流速。  图4 区域15内的粒子轨迹的状态表征：(A)FITC标记粒子在不同流速下的轨迹；(B)粒子通道内运动位置归一化分布；(C)在不同的流动条件下的各种聚焦状态。(D)在不同流速和加载时间下颗粒浓度的有效性；(E)不同流速下粒子分布的亮场图像 不同大小的粒子聚焦表征：在展示了SLDCOM通道内的颗粒聚焦稳定性和流速不敏感性后，本研究深入研究了对颗粒尺寸的不敏感性，以适应不同尺寸细胞的聚焦。首先选择了四种尺寸分别为7、10、15和30 μm的粒子来评估SLDCOM通道的聚焦性能。图5A的结果表明，不同大小的粒子可以在最佳流速下聚焦成线。为了显示粒子聚焦的精确影响，在出口点获得了含粒子样品的荧光图像（图5B）。所有混合的不同大小的粒子（直径分别为7、10和15μm）都可以在最后两个环的观测区域（12−15）中形成稳定的单流聚焦状态。本研究中检测的粒子具有a/H >为0.07的特征，其中a表示粒子的直径，H表示通道的高度。这一特性被认为对微通道内通过液体动力平衡成功聚焦粒子具有重要意义。随着环数量的增加，粒子在靠近内壁时形成一个集中而稳定的流动，最终在粒子到达环12和环13时出现了单流聚集点。结果表明，在SLDCOM通道内连续的长通道可以促进粒子聚焦的增强。值得注意的是，由于荧光微球轨迹的局限性，这一实验现象并不能证明不同大小粒子的聚焦位置完全一致。特别是直径为30 μm的大颗粒的动态轨迹以及不同环的路径轨迹。由于微通道较宽（900 μm宽度），实验中中没有遇到30 μm颗粒通过连续循环时的堵塞问题。随着时间的推移，这些粒子合并在一起，在内壁附近形成一个致密而稳定的流动，最终形成一个单一的聚焦流。结果表明，具有大维通道的器件能够有效地聚焦不同尺寸的粒子，具有高通量和可靠性。 此外流速在0.5~4mL/min时，不同大小粒子的聚焦效率均为>96%（图5C）。值得注意的是较大的颗粒表现出更好的性能。该现象可归因于微通道中增强的迪恩二次流导致粒子更快速地向通道内壁迁移。由于该设计具有增强和稳定涡旋的能力，因此能够实现不依赖于流速和粒径的聚焦。它为不同大小分布的不同粒子样品的分类和聚焦提供了一种很有前途的方法。为了评估SLDCOM通道聚焦癌细胞的有效性，利用三种不同的癌细胞（K562、HeLa和MCF-7细胞）进行了一项实验。这些细胞的大小差异显著，范围从11.8μm到21.1 μm。在荧光聚焦图像中同时观察到活细胞和非活细胞。在2 mL/min的流速下，它们可以有效地聚焦到通道出口内壁附近的一条宽为1 mm的单一流中（图5D）。细胞聚焦的位置位于距离内壁120 μm的位置。由于细胞独特的变形能力和尺寸特性，这一距离超过了粒子的位置。在不同的流速（1−3mL/min）下，评估了三种类型的癌细胞的聚集效率。所有三种类型的癌细胞都表现出了显著的聚焦效率水平，成功率超过96%（图5E）。MCF-7细胞的聚焦效果最高，而HeLa细胞的聚焦效果最低。对这一现象的潜在解释可能归因于三种不同的细胞类型的不同大小和变形能力。 此外设计了一个最佳的芯片结构，将粒子聚焦到通道的三维中心。为了实现这一目标，SLDCOM通道的出口被分为50μm和200 μm宽的平行通道（图5F）。由于通道高度为100 μm，因此选择了宽度为50 μm，导致长宽比为2，有利于三维粒子聚焦的形成。实验表明，MCF-7细胞可以以双流模式集中在出口O1区域的三维中心。在通过最后一个高纵横比为2的矩形通道后，可以在流量为0.5和2 mL/min的O2和O3区域看到三维聚焦。沿通道侧面的流速变化降低了剪切梯度升力，导致两个平衡位置减小到一个单一的位置（图5G）。较大的高宽比的通道有助于将粒子垂直对齐，形成单一焦平面，从而形成单个流中的粒子链。该优化后的SLDCOM通道在O3区域离壁50 μm处实现三维细胞聚焦，优于其他微流控聚焦技术。由于O2区域的细胞可能受到高剪切应力，可能影响其生存能力，从出口收集细胞并将其转移到培养皿中培养36小时。结果如图5H所示，所有三种类型的细胞都保持了很高的活力。说明优化的SLDCOM通道并没有对细胞活力产生不利影响。SLDCOM通道可以有效地实现不同大小的细胞在同一位置的三维细胞聚焦流量的变化，同时保持高通量和稳定性。 总结 该研究在螺旋微通道中设计独特的“大缓冲区”和“小缓冲区”的策略，成功地修改了迪恩二次流，减少了次流的幅度波动，稳定了螺旋芯片不同循环之间的加速度。通过一个简单的设计，实现了大维通道中流量和颗粒尺寸不敏感的三维聚集的效率提高。微流控芯片的三维细胞聚集不仅促进了小型流式细胞仪等仪器的发展，而且在单细胞分析、液滴操作和细胞图像分析方面均显现出了广泛的应用前景，提供了更精确、更全面的技术支持。  图 5：荧光粒子和不同大小的细胞的聚焦状态：(A)在2 mL/min下，在第15区有30μm、15μm、10μm和7μm粒子的轨迹；(B)出口处的粒子收集情况；(C)在变化的流速下，15区域粒子的聚焦效率；(D)用PI和细胞追踪器染色的MCF-7细胞在2 mL/min下15区域的运动轨迹；(E)位于15区域的三个癌细胞的聚焦效率；(F)用于三维单元聚焦的通道的出口设计优化；(G)2 mL/min下出口区MCF-7细胞的三维聚焦；(H)收集和培养的癌细胞的细胞活力； 论文链接： doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04897 原创：“扬清芯片” 前沿资讯 扬清芯片”前沿资讯“专题将于每周一为行业内相关从业者提供最新的行业资讯。往期精彩合集可在菜单栏"前沿资讯”查看。 欢迎将文章与公众号分享给更多关注微流控行业的朋友！  |
