微流控资讯 | 一种基于数字微流体平台的全自动识别多种呼吸道病原体的综合征诊断分析方法

图1: Virus Hunter2.0（VH 2.0）示意图

Virus Hunter 2.0（VH 2.0）由四部分组成：（1）磁性模块，利用电动磁棒来收集和吸引磁珠来实现洗涤/洗脱功能。（2）温控系统，其中加热模块集成于芯片上，设备上耦合制冷模块，仅采用比热容大的金属块便可实现最大5℃/s的冷却速率。（3）光学检测系统，采用led、滤光片、透镜、分束器和光电二极管等装置进行荧光检测。（4）DMF控制系统，用于控制电压改变液滴/电极间的润湿性以实现对不同尺寸的不同液滴的精确控制。

VH 2.0所用的芯片尺寸为132 mm×107 mm，具有检测病原体基因的特异性功能。除了常规功能外，在微型芯片上还实现了两项创新，即(1)将基于通道的微流体与用于RT-qPCR制备的数字微流体相结合和反应；(2)印刷电路板（PCB）中电阻式薄膜加热器和热传感器的集成。基于通道的微流体技术的引入允许在核酸提取序列中处理大量的缓冲液和磁珠。用聚碳酸酯（PC）预制了一个取样管、裂解室和两个洗涤室，并将液体试剂封装在一个特定的腔室中(图1 d ) 。 在数字微流控区域，采用ITO顶部玻璃与PCB平行产生0.6 mm间隙一致，中间修饰介电和导电层。通过DMF控制系统使液滴在腔室中平稳移动。qPCR的试剂（引物、探针、dNTP、酶）在特定反应室脱水预储存。

VH 2.0用户只需三个简单步骤：(1)添加样品-用咽拭子摇管10-20次，然后将样品加入500μL（最大加载1000μL)，盖盖；(2)插入芯片-将微芯片插入设备并启动分析软件；(3)读取结果，分析完成后获得结果。绝大部分工作在芯片上全自动完成，实现“sample-in-to-answer-out”。包括：(1)注入500 μL原样；(2)注入样品将20 μL、5 μL蛋白酶K和磁珠推入裂解室；(3)样品与1000 μL裂解缓冲液混合，60°C孵育2 min；(4)释放的RNA与磁珠结合；(5)芯片下的磁体向上移动收集磁珠；(6)磁体进入洗涤室1，与90 μL洗涤缓冲液1混合；(7)结合RNA与磁珠一起洗涤；(8)珠移至2洗涤室，与90 μL洗涤缓冲液2混合；(9)珠再次进行洗涤程序，（10）珠移至隔壁房间；（11）用60 μL洗脱缓冲液洗脱；（12）丢弃；（13）纯RNA移到分离区，（14）每滴5.55 μL；（15）分配的液滴移到PCR区域，用干燥的PCR预混物重新溶解；在这些单元中进行qPCR，并将荧光信号发送到VH 2.0分析仪。

图2 （a） RT-qPCR过程中芯片上反应点的设定温度和实际温度。

图3 电极驱动液滴从宏观通道到数字微流控室的示意图：(a)侧视图；（b）俯视图。

通过优化电阻器在PCB上的模式和实现PID控制(图2)，从95°C下降到60°C约需要13秒，上升到95°C。升温期间温度稳定性<±1.27°C，恒温温度稳定性<±为0.5°C。为了使大液滴从界面中逸出，通过在相邻的台阶高度电极上逐步插入高压，可以迫使洗脱液进入数字微流体控制区，如图3和视频所示。萃取过程结束后，将洗脱液驱动到l型电极阵列上生成反应液滴，每个液滴约为5.55 μL。

图4 片上和片外RNA提取比较程序和结果。两者之间的显著差异方法(p < 0.01)。

图5 稳定性测定时Ct值图

在芯片上的“sample-in-to-answer-out”工作流程的一百多次测试中表现出了卓越的稳定性。芯片上提取的循环阈值为N基因21.26±0.45，ORF1检测20.40±0.25，而它们分别为21.87 ± 0.22和21.08 ±0.38，由操作员使用商业化的试剂盒提取(图4).对于相同浓度的SARSCoV-2，N和ORF1基因检测的差异约为0.5。通过统计分析，与芯片外分析相比，芯片上分析可以达到回收率较少的阈值，这表明芯片提取的性能优于芯片外提取。由于在芯片中使用的体积较小，磁珠可以充分地接触到洗涤和洗脱缓冲液。因此，芯片提取的RNA浓度和/或纯度可能略高于手工提取。