图解微流控｜第30期

基因分型（genotyping）是指确定一条染色体上的一些基因、一段DNA序列或一部分遗传标记的连锁组合，实际上就是确定一条染色体上某个区段的单体型（haplotype）。基因分型是进行遗传基因多态性分析的必要途径，常用于疾病诊断、遗传学和法医学等应用研究，也是微流控芯片核酸研究的主要内容。微流控芯片实验室集快速、高效和集成化特点为一体，为大规模人群基因分型和多态性研究提供了一个高通量的技术平台。

10.2.1单核苷酸多态性检测

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，基因组内特定核苷酸位置上存在两种以上不同的核苷酸，其中最少一种在群体中的出现频率不少于1％（图10-10）。

SNP是继第一代的RFLP（限制性片段长度多态性）及第二代的STR（微卫星）的第三代遗传标记，可用于致病基因的定位、克隆和鉴定。在人类基因组中SNP最大程度地代表了不同个体之间的遗传差异，在基因组学、功能基因组学及药物基因组学研究中发挥重要作用。继人类基因组计划完成后提出的“国际人类基因组单体型图”（HapMap）计划就是要通过对个体全基因组中基因组序列上常见的SNP多态位点进行分析，构建出整合人类遗传多态信息的“单体型图”，以期为疾病易感性、药物敏感性和人类进化研究提供最基本的信息与分析工具。如果使用现行的方法，即使是对基因组中部分SNP位点进行检测费用也极其昂贵。因此，建立和发展大规模、高通量、低成本的SNP分型技术就成为一个重要的解决途径。

SNP基因分型方法有多种，其中，直接测序法即对待检测片段进行直接扩增、测序，被认为是最准确的方法。以微流控芯片为平台的SNP基因分型，通常采用基于PCR基础上的分子技术并结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析来实现。

血管紧张素原（angiotensinogen, AGT）基因是高血压的候选易感基因。研究证实，AGT基因启动子区存在多个多态性位点，这些位点的多态性在不同人群中分布以及对血压调控的影响程度不尽相同^{[12, 13]}。作者所在实验室利用自行研制的PMMA芯片、芯片-激光诱导荧光检测系统，并结合RFLP分析，对本地区226例人群中AGT基因核心启动子区A（-6）G位点基因多态性进行了分析^[14]，见图10-11。

实验中以标准100 bp dsDNA片段作为内参与酶切产物混合进样，以准确判定DNA片段大小。其中出现129 bp、107 bp和55 bp 三个片段的为AA纯和型，出现184 bp、107 bp、55 bp 三个片段的为GG纯和型；出现184 bp、129 bp、107 bp和55 bp 四个片段的为AG杂合型。对不同人群AGT基因等位基因（A、G）和基因型（AA、AG、GG）频率比较发现，本地区高血压人群AGT基因核心启动子区域-6位点存在A/G基因变异，其中A等位基因频率明显高于G等位基因频率。研究中所有样品同时采用平板电泳进行对照，芯片电泳在分析时间和样品用量方面显示出明显的优势。这样一种高效、快速的分析技术，如联之以高通量等特征，将为大规模人群遗传学研究和基因多态性分析提供一种潜在的技术平台。

遗传性血色素沉着症是西方较常见的一种由铁代谢异常所引起的遗传性疾病，其中铁代谢调节基因（HFE）的多个SNP位点单个碱基的替换突变与该病发生密切相关^[15]。针对不同SNP位点，建立和发展高通量的基因分型和点突变检测技术，对人群的遗传学筛查和疾病的早期诊断具有重要意义。Manage等将HA和SSCP方法联用，成功用于HFE基因多个SNP位点点突变的快速检测^[16]。为进一步满足高通量遗传变异筛查需要，Mathies等研制开发了一种阵列式玻璃微流控芯片，实现了对大量样品HFE基因常见点突变（C282Y，H63D，S65C）的检测和基因分型^[17]。该芯片有96根通道呈放射状排列于直径150 mm的圆盘状芯片上，分离通道配有相应微电极控制样品进样和分离。该芯片系统与等位基因特异性扩增方法相结合，以聚丙烯酰胺为筛分介质，以四色荧光法为检测方式，96个样品检测仅用10 min。这样一种以微流控芯片为基础的高通量基因分型技术，为大规模基因变异和人群筛查提供了一个强有力的技术平台。

在上述工作基础上，Mathies研究组还设计了一种更高通量的微流控芯片。如图10-12，384根通道呈放射状排列于直径20 cm的芯片上，圆盘直径20 cm，每条通道宽60 µm，深30 µm，有效分离距离8.0 cm，采用四色荧光扫描检测方式。

利用该系统并结合RFLP分析，对384个样品基因突变检测仅用325 s，基因分型准确率达98.7%^[18]。图10-13为利用该芯片所作的HFE基因突变检测结果，其中第1条电泳图谱为野生型突变，第379条电泳图谱为杂和型突变。这也是迄今为止样品分析通量最高的一种微流控芯片。

10.2.2短串联重复序列多态性检测

短串联重复序列（short tandem repeats, STRs），又称微卫星标记，广泛存在于原核和真核生物的基因组中，是具有长度多态性的DNA序列，一般长度为100-500 bp，其核心部分由2-6个bp的重复序列构成，两侧是保守的侧翼序列^{[19, 20]}（图10-14）。

STR种类多，多态信息含量高，被认为是理想的遗传标记，用于单基因病致病基因定位、遗传图谱构建、遗传连锁分析，以及人群个体识别等方面。

STR分型方法具有简便、准确度高、扩增片段大小适中，适于DNA降解检材等特点，目前已发展为个体识别的主要标记。如今STR各个位点的等位基因均采用数字命名，如（TPOX 11/12），适合于构建大规模的DNA-STR遗传标记数据库。法医上常用的STR多为4bp重复单位，理论上要求分辨率必须在4 bp以上，但由于一些STR位点（比如TH01）存在核心序列的非整数倍重复和基因的突变，实际上要求分辨率须达到1-2 bp。

在微流控芯片上进行STR基因分型是开展遗传连锁分析和法医学应用的潜在平台。常规STR位点的等位基因分析是结合不同STR位点的等位基因特异性PCR扩增与凝胶电泳进行基因分型（图10-15）。

毛细管电泳曾以其高效快速的分离特点在法医学STR基因分型中起到重要作用，微流控芯片将使这种分型过程更加规模化和通量化。

Ehrlich研究组在利用微流控芯片进行法医学STR基因分型方面开展了一系列工作。早期曾利用2.6 cm长的单通道硅芯片，以线性聚丙烯酰胺为筛分介质，500V/cm分离场强，对4个常用STR位点（CSF1PO、TPOX、THO1、vWA）的基因分型时间仅用50 s^[21]。此后，又通过双色荧光检测，实现了对8个STR位点的基因分型^[22]。为进一步改善分辨并增加分析通量，他们将分离通道延长为11.5 cm，并采用四色激光诱导荧光检测，实现了对包含15个STR位点和1个性别位点的复合PCR扩增产物的检测,并达到单碱基分辨^[23]，其中包含了美国联邦调查局（FBI）公布的13个核心STR位点（combined DNA index system,简称CODIS），整个检测过程不足35 min，并显示出很高的检测灵敏度。

PowerPlex® 1.2系统是多基因座复合扩增体系，采用双色荧光标记检测9个基因位点，即8个STR基因位点和1个性别基因（amelogenin）位点。对Promega公司 PowerPlex 1.2等位基因标准品和内控带的微流控芯片电泳结果见图10-16，检测时间仅用20 min。分别用特定荧光探针标记不同引物，复合PCR反应在一个反应管里同步扩增，并在单通道芯片电泳进行基因分型。图10-17是STR常见THO1位点不同等位基因的芯片电泳图谱。其中对TH01位点等位基因9.3和10分离检测的碱基分辨能力优于0.75 bp。在上述工作基础上，结合阵列多通道芯片电泳和自动进样装置，微流控芯片技术将为高通量、自动化的STR分型提供一条新的途径。

图10-18是一套基于微流控芯片平台的便携式法医学基因分析系统。由微流控芯片和装置两部分组成，前者含STR片段扩增及分离单元，后者实现芯片控制和产物的四色荧光检测。该便携式法医学基因检测装置集温控、电泳分离、四色荧光检测等单元于一体^[24]，包括一个488 nm双频二极管激光器、一套四色荧光的光学检测系统、PDMS芯片气动阀、PCR控制电子元件和四个控制芯片电泳的高压电源，装置尺寸为12×10×4英寸。

芯片结构如图10-19所示，集PCR反应池、微泵阀和电泳分离于一体。

文章来源：《图解微流控芯片实验室》林炳承、秦建华 著