图解微流控｜第26期

激光诱导荧光检测法灵敏度高，适合于芯片微通道内各种对象的高灵敏度检测，但是很多物质没有荧光性质，需要使用荧光标记，在很多实验中由于不能确保标记上染料物质后被测物质的性质是否发生变化，直接影响实验结果的可信度，凡此种种使激光诱导荧光检测器的应用受到一定限制。相比较而言紫外吸收检测器则没有这层顾虑，紫外吸收检测器是一种通用型光学检测器。

微流控芯片系统中由于芯片微通道一般仅为数十微米甚至几微米，其可提供的吸收光程有限，再加上紫外吸收对芯片的材料有一定要求，因此现阶段紫外吸收光度法在微流控芯片检测中的应用还远不如高效液相色谱和毛细管电泳广泛。但作为一种普遍使用的检测方法，紫外吸收光度法在微流控芯片研究领域应该发挥更为重要的作用。

鉴于紫外吸收光度检测对于芯片结构和材质提出一些新的要求，本小节除讨论紫外检测器结构之外还将就紫外微流控芯片的特点予以简要说明。

9.4.1 紫外吸收光度检测芯片的特殊要求

芯片紫外吸收光度检测存在的主要问题是检测灵敏度低，难以满足低浓度生化样品的检测要求。解决的办法除了优化检测器光路之外，更多的则应该是就芯片本身来考虑，其主要方法是使用紫外吸收小的石英等为芯片材料，尽可能增加吸收光程，进行样品预富集等。

（1）芯片材料

常用的玻璃、塑料等芯片材料对紫外光都有较大的吸收，不适宜用于紫外检测，反之，石英、PDMS等紫外吸收小的芯片材料则是较为合适的选择。

作者课题组设计开发了两种紫外吸收检测用芯片：PDMS石英杂交芯片^[15]和石英芯片^[16]。杂交芯片是在PDMS或石英上刻蚀芯片通道结构，用另一片石英或PDMS为盖片进行封合。严格意义上来说PDMS在紫外区尤其是远紫外区有较强的吸收，所以在使用中应该尽可能降低PDMS的厚度，以减小其对光的吸收。石英芯片则采用HF低温键合技术，设计局部加压模具，以大幅度降低石英芯片制作难度和成本。这两种芯片在使用中均取得了较好的结果。

（2）吸收光程

根据紫外吸收朗伯-比尔定律，吸光度同吸收光程成正比，对于高浓度样品使用普通尺度的芯片就可以满足检测要求，但对于低浓度样品则必须设计和制作长光程结构的芯片。

现阶段微流控芯片通道深度一般在15～30 μm，在垂直于芯片通道方向很难实现长光程检测，而在水平方向则容易得多。光在芯片内的水平入射和出射是实现水平方向吸收光度检测的关键问题。最常用的方法是用光纤耦合芯片通道两侧刻蚀的波导管来实现^[17-20]。

如图9-16所示^[20]，入射光经光纤耦合到芯片平面波导管，然后轴向入射到“Z”型流通池，透射光经平面波导，再透过光纤引入检测器，采用这种芯片结构增长了吸收光程。

Hahn等设计了一种三层PDMS光校准吸收光度检测集成芯片，用于在散射光对吸收光检测干扰很大造成吸收严重偏离朗伯-比尔定律情况下的检测^[21]。该芯片集成了用于光校准的微透镜和光学狭缝，其示意图如图9-17所示。

另外也有通过检测窗的多级反射来增加检测光程的^[22]，其示意图如图9-18所示。

（3）样品富集

在芯片上增加样品富集单元，大幅度增加最终流经检测池的样品浓度，也可提高紫外检测的灵敏度，相关内容可见本书第5章样品预处理论述。

9.4.2 单点紫外吸收光度检测

单点检测是毛细管电泳常用的紫外检测方式，将这种检测的光路稍作修改即可移植到微流控芯片平台上，其中最重要的是采用柱面镜将光聚焦成一个矩形光带投射到芯片通道上。

作者课题组研发的紫外可见吸收光度微流控平台，外观如图9-19（a）所示。其紫外检测器采用可变波长方式，在光栅单色器作用下，检测波长可在190～740 nm范围内任意选择，图9-19（b）为其光路示意图。

在上述能完成简单电泳操作的紫外芯片电泳仪的基础上作者课题组进一步发展了集成紫外微流控芯片平台，该平台扩展了八电极高压控制系统和微泵等复杂流体控制模式，可在芯片上完成复杂样品的预处理操作，能直接进行血液、尿液、中药等复杂体系的分析。在该平台上直接进行对氨基苯甲酸的检测其检测限可达到1 mg/mL，集成样品预浓缩后样品检测限大大降低，峰高RSD小于1%（n=10）。标准物质苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸混合物以及实际样品中天麻水提取液均在该平台上得到快速分离检测，如图9-20所示^[23]。

9.4.3 全通道成像紫外吸收光度检测

和单点检测不同的是全通道线性成像检测技术^[24、25]，如图9-21所示，氘灯光源发出的紫外线经光学器件单色，聚焦到带有透光狭缝石英芯片的整个分离通道上，透过光被位于通道另一侧的线性二极管阵列检测器收集。

化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。化学发光检测法是公认的高灵敏度检测方法之一，其检测灵敏度可以和激光诱导荧光相媲美。与其它光学检测方法相比，化学发光检测最大的优势在于其不需要光源，仪器设备简单，更容易实现微型化和集成化，因此更适合用做微流控芯片的检测装置。

化学发光是分子发光光谱分析法的一种，是通过检测发光强度来确定待测物含量的一种痕量分析方法。其机理是基态分子吸收化学反应中释放的能量，跃迁至激发态，处于激发态的分子以光辐射的形式返回基态，从而产生发光现象。

9.5.1 单通道化学发光检测

微流控芯片化学发光单点检测实现起来比较简单，一般方法是将光电检测器直接置于反应通道的下方，因其不需要复杂的光路系统，因此大多由研究者自行搭建而成。

任吉存等在PDMS芯片上采用等电聚焦与在线化学发光检测相结合的方法测定了亚血红素类蛋白^[26]。芯片结构与装置如图9-22所示。

9.5.2 多通道化学发光检测

阵列微流控芯片的发展对设计具备多通道同时检测能力的化学发光检测器提出了要求，与LIF相比，构建多通道化学发光检测器更为容易，可采用单点扫描和CCD成像等。

作者课题组立足实验本身需要设计了一种旋转扫描式化学发光检测器，可应用于多通道阵列化学发光检测^[27]，光路如图9-23（a）所示，装置仪器图如图9-23（b）所示。

基于该多通道化学发光检测系统，课题组进行了五通道皮质醇的检测，图9-24（a）为50 ng/mL皮质醇检测重现性谱图，峰高相对标准偏差为3.5%（n=5），不同浓度下的标准曲线见图9-24（b）。

文章来源：《图解微流控芯片实验室》林炳承、秦建华 著